如圖所(suǒ)示(shì)，質粒(lì)提(tí)取之後(hòu)進(jìn)行(háng)瓊脂(zhī)糖凝(níng)膠電(diàn)泳，出現(xiàn)明顯的(dí)RNA條帶，說(shuō)明有RNA汙(wū)染(rǎn)。

原因及(jí)解(jiě)決(jué)方法：

（1）未(wèi)在緩(huǎn)衝液 RS*中(zhōng)事(shì)先(xiān)加(jiā)入RNase A。解(jiě)決(jué)方(fāng)法(fǎ)：補(bǔ)加(jiā)RNase A。

（2）加入(rù)RNase A的(dí)緩衝(chōng)液 RS*長期(qī)保存於(yú)室溫(wēn)，導致(zhì)RNase A活性(xìng)下降。解(jiě)決(jué)方法(fǎ)：每次(cì)使用(yòng)後置(zhì)於 4℃保存。若(ruò)長期不(bù)用，置(zhì)於-20℃保(bǎo)存。

（3）細(xì)菌(jūn)過量,RNase A不能有效(xiào)降解(jiě)RNA。解決方(fāng)法：將(jiāng)細菌用量(liáng)減(jiǎn)半(bàn)或增加RNase A在緩(huǎn)衝液 RS*中的濃(nóng)度。

（1）菌(jūn)體(tǐ)裂解和中(zhōng)和(hé)過程中(zhōng),劇(jù)烈(liè)混(hùn)合造成基(jī)因組DNA斷裂所(suǒ)致。解決(jué)方法：溫和(hé)地(dì)進行(háng)菌(jūn)體的裂解和(hé)中(zhōng)和(hé)。

（2）加裂解(jiě)液(yè) LB時(shí)操作時間過長(cháng)，造成基因組(zǔ)DNA斷(duàn)裂所致(zhì)。解決方法：將(jiāng)裂解(jiě)步驟控(kòng)製在5分鐘內完(wán)成。

（3）細菌的(dí)質(zhì)量差(chà)（反復凍融(róng)的細(xì)菌，陳舊的(dí)細(xì)菌，培(péi)養(yǎng)條件(jiàn)不(bù)合(hé)適的(dí)細菌等）中有(yǒu)許多斷裂或(huò)降解而(ér)遊(yóu)離(lí)的(dí)基因組DNA，使用(yòng)生長良好的(dí)新鮮細菌。

如圖(tú)右所示，質粒(lì)提取之後進(jìn)行(háng)瓊脂(zhī)糖凝(níng)膠(jiāo)電泳，開環(huán)質(zhì)粒的(dí)占(zhān)比(bǐ)約(yuē)20%，說明超螺旋(xuán)比(bǐ)例低，一般超螺旋比例(lì)需(xū)要(yào)＞90%，一(yī)般(bān)來(lái)說(shuō)超(chāo)螺旋比例(lì)越高(gāo)，質粒(lì)的穩定(dìng)性越高(gāo)，高超(chāo)螺旋比(bǐ)例的(dí)質粒(lì)在(zài)轉(zhuǎn)染效率(shuài)，基因表達水平(píng)等(děng)方麵(miàn)具有更(gēng)好(hǎo)的表現(xiàn)。

原因：裂解(jiě)時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，加入裂解液後裂解時間不(bù)應(yīng)超過5分鐘，以免質粒受到破(pò)壞

解決方法：優化裂解(jiě)時間；確(què)保質(zhì)粒的結合(hé)和(hé)所(suǒ)有溶液都(dū)在室(shì)溫下(xià)進行(háng)，減(jiǎn)少(shǎo)離心(xīn)力(lì)對質(zhì)粒(lì)超螺旋結構的影響(xiǎng)，因(yīn)為過(guò)度(dù)的離心可能會破(pò)壞(huài)質粒的超(chāo)螺旋結構(gòu)。

常規質(zhì)粒DNA純(chún)化(huà)中(zhōng)，質粒DNA仍需(xū)要從(cóng)55%蛋(dàn)白質，20%RNA，3%內毒素(sù)和3%基因組(zǔ)DNA中分離(lí)，在(zài)質粒DNA製(zhì)備(bèi)的(dí)菌體裂(liè)解過(guò)程中，內毒素(sù)分子(zǐ)被(bèi)釋(shì)放到溶(róng)菌液(yè)中。由於內(nèi)毒(dú)素常形成(chéng)囊狀(zhuàng)結(jié)構，其(qí)分子(zǐ)量(liáng)，電荷(hé)性和(hé)疏水性都(dū)與質(zhì)粒DNA相似(sì)，常用(yòng)的(dí)純(chún)化方(fāng)法很難將內毒素(sù)與(yǔ)質粒(lì)DNA分(fēn)開。內毒(dú)素會降(jiàng)低(dī)原(yuán)代(dài)細胞和(hé)敏感培養(yǎng)細(xì)胞(bāo)的轉染效率，幹擾(rǎo)免疫細胞的體外(wài)轉(zhuǎn)染。由於(yú)實(shí)驗目的不(bù)同，對質粒DNA的內毒素(sù)要求(qiú)亦(yì)不(bù)同，尤(yóu)其是在細胞(bāo)轉染(rǎn)，基(jī)因(yīn)沉默研究(jiū)，基(jī)因治療(liáo)等(děng)過程中，對質粒質(zhì)量(liáng)，內毒(dú)素水平要求更(gēng)為苛(kē)刻(kè)，對(duì)於(yú)非敏感型的(dí)的轉染(rǎn)實(shí)驗，要求(qiú)內毒素(sù)殘留0.1～2.5 EU/ug，對(duì)於(yú)敏感型(xíng)的的轉染實驗，要求(qiú)內毒素殘留＜0.1 EU/ug。

原(yuán)因(yīn)：內毒(dú)素去除(chú)時(shí)操(cāo)作不當(dāng)或者(zhě)未選(xuǎn)擇合適(shì)的(dí)試(shì)劑(jì)

解(jiě)決(jué)方(fāng)法(fǎ)：

（1）如(rú)果采用(yòng)的內毒素清除的(dí)方(fāng)法，離(lí)心之(zhī)後(hòu)，上(shàng)層水(shuǐ)相(xiāng)含DNA，下層(céng)藍色油狀相(xiāng)含內毒(dú)素和(hé)其它雜(zá)質。這(zhè)時(shí)注(zhù)意不要吸到藍(lán)色油狀層，裏(lǐ)麵(miàn)含內毒素等雜(zá)質。

（2）在(zài)使用樹(shù)脂純化(huà)係(xì)統去(qù)除(chú)內(nèi)毒素時(shí)，需要先(xiān)活化(huà)樹脂，然後使(shǐ)用(yòng)平衡(héng)緩衝(chōng)液平(píng)衡(héng)樹脂(zhī)，以(yǐ)確保最佳的去除效(xiào)率(shuài)。