不(bù)知(zhī)道(dào)大(dà)家是否會遇(yù)到細胞(bāo)凍存(cún)的(dí)時(shí)候狀(zhuàng)態非常(cháng)不錯，結果等(děng)到(dào)需(xū)要(yào)用到(dào)該細胞的時(shí)候(hòu)怎麼也復(fù)蘇不(bù)起(qǐ)來的情(qíng)況(kuàng)啊(ā)？或(huò)許(xǔ)可(kě)能是凍(dòng)存(cún)細胞的(dí)時(shí)候(hòu)出(chū)現(xiàn)了(liǎo)什麼差錯？

一.細胞(bāo)凍存的原(yuán)則：慢(màn)凍，細(xì)胞(bāo)在冷凍過(guò)程(chéng)中，如果降溫過快，會(huì)形(xíng)成大(dà)的冰晶(jīng)，這(zhè)些(xiē)冰晶會破壞(huài)細(xì)胞(bāo)結構，導致細胞(bāo)死(sǐ)亡。

詳(xiáng)細(xì)版本見《》

二.凍(dòng)存(cún)液(yè)的配置：

常用配置(zhì)比例：培養基:血清(qīng):DMSO=7:2:1

適用(yòng)於(yú)大多(duō)數細胞(bāo)係(xì)，能(néng)夠保(bǎo)證(zhèng)細胞在(zài)凍存過程中有(yǒu)較高(gāo)的存(cún)活(huó)率(shuài)。

血(xiě)清:DMSO=9:1

適用(yòng)範(fàn)圍(wéi)：適用(yòng)於需要(yào)長(cháng)時(shí)間保存(cún)或者具(jù)有(yǒu)特(tè)別珍貴性(xìng)的(dí)細胞(bāo)係。血(xiě)清含量(liáng)高(gāo)，可以更好(hǎo)地保護細胞，並確保(bǎo)其(qí)在(zài)凍存後依然保持較好的生物學特性。

無血清凍(dòng)存液(yè)：適用於(yú)某些對(duì)血清敏感(gǎn)或(huò)需(xū)要避免血清(qīng)成分的細(xì)胞係(xì)。配置比(bǐ)例：如10% DMSO+90%專(zhuān)用(yòng)無血清(qīng)培養基，或其他(tā)適(shì)合細胞生長的無血清替代品。

1.不(bù)要將DMSO直(zhí)接加入含(hán)有細胞的(dí)培養(yǎng)基中，因為(wéi)DMSO溶於(yú)培養基時會釋(shì)放(fàng)大(dà)量熱量，可能燙傷細(xì)胞(bāo)。在(zài)加(jiā)入(rù)細(xì)胞(bāo)前(qián)，可以將配置好的凍(dòng)存液放於(yú)4℃進(jìn)行(háng)預(yù)冷（預冷步驟並(bìng)非(fēi)必(bì)需(xū))。DMSO在4°C時(shí)毒性會大大減(jiǎn)弱(ruò)，且滲透速度加快，有助於保(bǎo)護細(xì)胞(bāo)。

2.若使用凍(dòng)存盒(hé)進行凍(dòng)存，必須將凍存(cún)盒解凍至(zhì)室溫(wēn)（避免(miǎn)溫度(dù)驟變對(duì)細(xì)胞的損(sǔn)傷：如果(guǒ)直(zhí)接(jiē)將(jiāng)冷(lěng)凍的(dí)凍存盒從(cóng)低(dī)溫環境取(qǔ)出，並立即打開(kāi)或(huò)處理(lǐ)，細(xì)胞(bāo)會(huì)受到(dào)溫度(dù)驟(zhòu)變(biàn)的(dí)影(yǐng)響。

溫度的急劇上升可(kě)能導(dǎo)致細胞內(nèi)冰晶的形(xíng)成(chéng)或擴大(dà)，對(duì)細胞(bāo)膜和細(xì)胞器造成機械性(xìng)損傷，進而(ér)影(yǐng)響(xiǎng)細胞的存活率。)

3.把(bǎ)握細胞凍(dòng)存(cún)的(dí)密(mì)度：應確(què)保細胞處於對數(shù)生(shēng)長期，形(xíng)態正常(cháng)，無汙染，且(qiě)細(xì)胞密度足(zú)夠大，因為(wéi)凍(dòng)存(cún)和復蘇的過程中不可(kě)避(bì)免(miǎn)會導(dǎo)致部分細胞死亡。

1.配(pèi)置好(hǎo)細(xì)胞凍存(cún)液，置於4℃預冷(lěng)備(bèi)用

2.將待凍(dòng)存(cún)的細(xì)胞(bāo)從(cóng)培養(yǎng)箱中取出(chū)，棄去舊的(dí)培養基，PBS洗(xǐ)滌(dí)，對(duì)於貼壁細(xì)胞(bāo)，加(jiā)入適(shì)量(liáng)胰酶消化液，將培養皿放(fàng)入(rù)37℃培養(yǎng)箱中(zhōng)消(xiāo)化數(shù)分(fēn)鐘（消化(huà)時間根據細胞類型而定(dìng)）當觀(guān)察到(dào)細(xì)胞大塊大塊(kuài)地從皿(mǐn)底(dǐ)脫(tuō)落時，加(jiā)入(rù)等(děng)體積的(dí)wan全(quán)培養(yǎng)基終(zhōng)止(zhǐ)消(xiāo)化。離心(xīn)收集細胞(bāo)；對(duì)於懸浮細胞(bāo)直接離心收(shōu)集

3.向離心管(guǎn)中(zhōng)加(jiā)入適量(liáng)的凍存液，用(yòng)移(yí)液器輕輕吹(chuī)打(dǎ)細胞(bāo)沉澱，使(shǐ)細(xì)胞均匀懸浮於凍存(cún)液(yè)中。

4.將(jiāng)重懸(xuán)後(hòu)的細胞懸液分裝至無菌凍存(cún)管(guǎn)中，凍存管放(fàng)入-80過(guò)夜，次日轉移置液(yè)氮保存。