一(yī)，MLPA 是(shì)什(shí)麼
？

MLPA 是一(yī)種用於(yú)檢(jiǎn)測特(tè)定核(hé)酸序(xù)列(liè)拷(kǎo)貝(bèi)數變異的(dí)高通量，半(bàn)定量技術(shù)。它可以同(tóng)時(shí)檢測多(duō)達50個(gè)不(bù)同的靶序列(liè)，包(bāo)括基(jī)因缺(quē)失，重復，甲基(jī)化狀態以及(jí)點突(tū)變(biàn)。

核心特(tè)點(diǎn)：

1. 高(gāo)通量： 一(yī)次(cì)反應可檢測40-60個(gè)不同(tóng)靶(bǎ)位(wèi)點。

2. 高效經(jīng)濟(jì)： 僅(jǐn)需(xū)少量(liáng)DNA（20-100 ng），就(jiù)能獲得(dé)相(xiāng)當於(yú)數(shù)十(shí)次傳統PCR或(huò)qPCR實驗(yàn)才(cái)能(néng)得到的(dí)信息。

3. 靈敏(mǐn)度高： 可(kě)以檢測出雜合(hé)性(xìng)缺失和(hé)單拷(kǎo)貝的變異。

4. 應(yīng)用廣(guǎng)泛： 可用於(yú)DNA和(hé)RNA分析(xī)。

二， MLPA 技術原理（分步詳解(jiě)）

MLPA 技術的巧(qiǎo)妙之(zhī)處在於(yú)將(jiāng) 探(tàn)針(zhēn)連(lián)接(jiē) 與 PCR 擴(kuò)增相結合。整(zhěng)個過程(chéng)可以分為(wéi)四個(gè)主要(yào)步驟：

第一步(bù)：DNA 變性

將(jiāng)樣本DNA（通常是100-200 ng）加(jiā)熱(rè)至98°C，使其雙鏈解(jiě)鏈(liàn)為單鏈。

第(dì)二步(bù)：探針雜交

降(jiàng)溫至(zhì)60°C左右，使MLPA特異性(xìng)探(tàn)針與(yǔ)目標DNA序(xù)列進行雜交(jiāo)。

MLPA探(tàn)針的(dí)結構（最關鍵的部(bù)分(fēn)）：

每(měi)一對MLPA探(tàn)針(zhēn)都(dū)包括兩(liǎng)個半(bàn)探(tàn)針(zhēn)：

左半(bàn)探針： 包(bāo)含一個(gè)通用(yòng)引物(wù)序列和一(yī)個靶標(biāo)特異性序列。

右半探針： 包含(hán)另一個(gè)通用引物序(xù)列，一個靶(bǎ)標特異性序列(liè)和一個(gè)填(tián)充(chōng)序(xù)列。

這兩(liǎng)個半(bàn)探針的(dí)靶標(biāo)特異(yì)性序列是(shì)相鄰(lín)的(dí)，隻有當(dāng)它(tā)們同(tóng)時與目標DNAwammei互(hù)補結合時(shí)，才(cái)能進(jìn)行(háng)下一步。

第三步(bù)：連接(jiē)反應

加入 連接酶。隻有兩個半(bàn)探(tàn)針(zhēn)都wanquan雜交到靶(bǎ)序列上(shàng)，它們才(cái)會首尾相(xiāng)連，被連接(jiē)酶共(gòng)價連接成一條(tiáo)完(wán)整(zhěng)的核(hé)酸(suān)鏈。

關(guān)鍵(jiàn)點(diǎn)： 如果靶序(xù)列發(fā)生(shēng)缺失(shī)或(huò)點突(tū)變(biàn)，導(dǎo)致探(tàn)針無法wanquan結(jié)合，連(lián)接反應就(jiù)不(bù)會發生。這是(shì)MLPA技術(shù)特異(yì)性的基礎。

第(dì)四步(bù)：PCR 擴(kuò)增

使用一對(duì)通(tōng)用熒光標(biāo)記(jì)引(yǐn)物對(duì)所(suǒ)有(yǒu)成功連(lián)接(jiē)的(dí)探針進行(háng)PCR擴(kuò)增。

因為所(suǒ)有探針都含有相同的通(tōng)用引(yǐn)物(wù)序列，所以(yǐ)可以(yǐ)用(yòng)同(tóng)一對引物擴增(zēng)所有不(bù)同(tóng)的靶標(biāo)。

為什(shí)麼能(néng)定量
？

每(měi)個連接(jiē)成功的探針，其(qí)擴(kuò)增產物的長度(dù)是不(bù)同(tóng)的(dí)（由右(yòu)半(bàn)探針中的(dí)“填充序列(liè)"長度決(jué)定(dìng)）。

通過(guò)毛細管電(diàn)泳分(fēn)離(lí)這些不同(tóng)長度(dù)的產物(wù)，並通過(guò)檢(jiǎn)測熒光(guāng)強度(dù)來定量。

基本原(yuán)理： 在(zài)一個樣本中(zhōng)，某(mǒu)個靶(bǎ)序列的拷貝數(shù)越高，對(duì)應的(dí)完(wán)整探(tàn)針就越多，PCR擴(kuò)增後該(gāi)長度(dù)片段的熒光信號(hào)就越強(qiáng)。

三(sān)， MLPA 工(gōng)作流(liú)程概(gài)要

樣本DNA製備(bèi)。

MLPA反應： 將(jiāng)DNA與MLPA探針混合物(wù)，緩(huǎn)衝液等混合，進行(háng)過夜雜交和連(lián)接反(fǎn)應。

PCR擴增(zēng)： 使用通(tōng)用引(yǐn)物進行擴增(zēng)。

片段分析(xī)： 使(shǐ)用毛細管(guǎn)電(diàn)泳(yǒng)儀(yí)進行(háng)分析。

數據分析： 專用軟件將(jiāng)樣本的(dí)信號(hào)峰(fēng)值與正常對照樣本進行(háng)比(bǐ)較(jiào)，通(tōng)過計(jì)算比值(zhí)來(lái)判定拷貝數(shù)。

比值(zhí) ≈ 1.0： 正常(cháng)拷(kǎo)貝(bèi)數（二倍(bèi)體(tǐ)）。

比值 ≈ 0.5： 雜合性缺失(shī)（單拷貝）。

比值(zhí) ≈ 0： 純合性缺失（無(wú)拷貝）。

比(bǐ)值 ≈ 1.5： 重(zhòng)復（三(sān)拷(kǎo)貝(bèi)）。

四(sì)， MLPA 的主要(yào)應(yīng)用(yòng)領域

MLPA技(jì)術因其(qí)高效和靈活(huó)，被廣泛應用(yòng)於：

1. 遺(yí)傳(chuán)病診斷(duàn)：

杜氏/貝(bèi)氏(shì)肌營養不良症： 檢測(cè)DMD基因大(dà)片(piàn)段(duàn)缺失(shī)/重復。

2. 脊髓(suǐ)性肌weisuo症： 檢測(cè)SMN1基因外(wài)顯(xiǎn)子7的純合缺(quē)失。

遺(yí)傳性(xìng)腫瘤(liú)綜合征： 檢(jiǎn)測(cè)BRCA1/2等基因的(dí)缺失(shī)/重復。

染(rǎn)色體(tǐ)微缺失(shī)/微重復綜合征： 如(rú)22q11.2缺失綜(zōng)合征(zhēng)（迪喬治綜合征），威(wēi)廉姆斯(sī)綜(zōng)合(hé)征等(děng)。

3. 腫瘤(liú)學：

檢測(cè)癌(ái)基因的擴增（如(rú)HER2在(zài)乳(rǔ)腺(xiàn)癌中的(dí)擴(kuò)增(zēng)）。

檢(jiǎn)測抑癌(ái)基因(yīn)的缺失。

4. 表(biǎo)觀(guān)遺傳學(xué)分(fēn)析(xī)（MS-MLPA）：

這是一種特殊(shū)形式的MLPA，探針(zhēn)設計包含了對(duì)甲(jiǎ)基化敏感的(dí)限(xiàn)製性內切(qiē)酶的識別(bié)位點。

通(tōng)過(guò)酶(méi)切處(chǔ)理，可以(yǐ)區分甲基化和非甲基化的DNA，從(cóng)而用於(yú)檢測(cè)基因的甲基(jī)化(huà)狀態，如(rú)印(yìn)記基因疾病（Prader-Willi/Angelman綜合(hé)征(zhēng)）和腫(zhǒng)瘤中的(dí)基因(yīn)啟(qǐ)動子(zǐ)甲基化。

5. 基(jī)因分(fēn)型與(yǔ)點(diǎn)突變(biàn)檢(jiǎn)測：

通(tōng)過(guò)設計(jì)特殊的(dí)探針，可(kě)以檢測(cè)已知(zhī)的單核苷酸多態(tài)性或(huò)點突(tū)變。

五， MLPA 的(dí)優缺(quē)點

總(zǒng)結來(lái)說，MLPA是一種非常精(jīng)巧，實(shí)用且高(gāo)效(xiào)的靶向拷(kǎo)貝數(shù)分(fēn)析(xī)技術，在臨床(chuáng)分(fēn)子(zǐ)診斷和研(yán)究(jiū)中(zhōng)扮(bàn)演(yǎn)著(zhuó)重要(yào)的角色。

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