一(yī)， 試劑盒概(gài)述(shù)與原(yuán)理(lǐ)

  產品名稱(chēng)： E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit

  貨號：

  用途(tú)： 用於快速(sù)純化(huà)PCR，酶切，標記等反應後的(dí)DNA產物(wù)，去除(chú)引物(wù)，引(yǐn)物二聚體(tǐ)，dNTPs，鹽(yán)離子(zǐ)，酶等(děng)雜(zá)質。

  原(yuán)理： 基於(yú) 矽膠柱（HiBind® DNA Mini Column） 技(jì)術。在高鹽條件下，DNA會特(tè)異(yì)性地(dì)吸附(fù)到矽膠膜上，而雜質則被洗脫(tuō)。隨(suí)後(hòu)在(zài)低鹽(yán)緩衝液中將純(chún)淨的DNA洗(xǐ)脫下來。

  特點：

      快速： 整(zhěng)個過程可在15-20分(fēn)鐘(zhōng)內(nèi)完成。

      高效： 對100bp至10kb的DNA片(piàn)段回收(shōu)率(shuài)高。

      高(gāo)純(chún)度(dù)： 純化後的DNA可直接(jiē)用於測(cè)序(xù)，克隆(lóng)，酶(méi)切，連接(jiē)等(děng)下遊實驗(yàn)。

二， 試(shì)劑(jì)盒組成（以(yǐ)D6492-01為(wéi)例，100次預裝(zhuāng)）

請在使用(yòng)前(qián)核(hé)對(duì)以(yǐ)下試(shì)劑是(shì)否齊(qí)全(quán)且充足(zú)：

1.  CP Buffer： 結合緩(huǎn)衝液(yè)（含(hán)高(gāo)濃(nóng)度離液鹽(yán)）。

2.  DNA Wash Buffer（濃(nóng)縮液）： 漂洗液，使(shǐ)用前必須按說明書要求加入(rù)無(wú)水乙(yǐ)醇進行(háng)稀釋(shì)（通(tōng)常(cháng)是在整(zhěng)瓶中(zhōng)加(jiā)入指(zhǐ)定體(tǐ)積(jī)的無(wú)水乙醇）。

3.  Elution Buffer： 洗脫(tuō)液（10 mM Tris-HCl， pH 8.5）。也可使用無菌去(qù)離(lí)子水（pH > 7.0）代替，但用(yòng)Elution Buffer洗脫效率通(tōng)常更高。

4.  HiBind® DNA Mini Columns： 吸(xī)附柱（2 mL）及(jí)收集管(guǎn)（2 mL）。

5.  說明書。

三(sān)， 標準(zhǔn)操(cāo)作流(liú)程(chéng)

實驗前準備：

  將DNA Wash Buffer按說(shuō)明書(shū)要求用(yòng)無水乙醇(chún)稀(xī)釋(shì)。

  將CP Buffer和(hé)Elution Buffer置於室溫(wēn)融化。

  準(zhǔn)備(bèi)好無水乙(yǐ)醇。

第一步(bù)：平衡(héng)結(jié)合(hé)條件

1.  向您的PCR反應液(yè)中(zhōng)加入(rù)5倍體(tǐ)積的CP Buffer（例(lì)如(rú)，50μL PCR產(chǎn)物(wù) + 250μL CP Buffer）。

2.  用移(yí)液器(qì)充(chōng)分吹(chuī)打混(hùn)匀(yún)。

第(dì)二(èr)步(bù)：DNA結(jié)合

1.  將(jiāng)混合(hé)物全部轉移到HiBind® DNA Mini Column中(zhōng)（柱子裝在2mL收(shōu)集管內）。

2.  室溫（15-25°C），≥10,000 x g 離心 30-60秒(miǎo)。

3.  棄去收(shōu)集管(guǎn)中(zhōng)的(dí)濾液，將柱子(zǐ)放(fàng)回同一收集管中(zhōng)。

第(dì)三步：漂(piāo)洗

1.  向柱子(zǐ)中加(jiā)入(rù) 700μL DNA Wash Buffer（已(yǐ)含乙(yǐ)醇
！）。

2.  室溫(wēn)，≥10,000 x g 離心 30-60秒(miǎo)。

3.  棄濾(lǜ)液(yè)，將柱子放(fàng)回收集管。

4.  重復步驟(zhòu)1-3一次（即(jí)總共(gòng)用Wash Buffer漂(piāo)洗兩次(cì)）。

5.  空離以(yǐ)cedi去(qù)除殘留(liú)乙醇(chún)： 將空(kōng)柱以最(zuì)大轉(zhuǎn)速(sù)（≥13,000 x g）離(lí)心(xīn) 2分鐘。這一步至(zhì)關重要(yào)，因為(wéi)殘留(liú)的乙醇(chún)會(huì)嚴重(zhòng)影(yǐng)響下(xià)遊(yóu)酶(méi)促(cù)反應。

第(dì)四步(bù)：洗(xǐ)脫DNA

1.  將柱子轉移(yí)到一(yī)個新(xīn)的(dí)，幹(gān)淨的 1.5mL 離心(xīn)管(guǎn)中。

2.  向(xiàng)柱子(zǐ)矽膠膜的(dí)正中央，懸空(kōng)滴(dī)加 15-30μL Elution Buffer（或(huò)無菌水(shuǐ)）。

3.  室(shì)溫(wēn)靜置 2-5分鐘(zhōng)，使(shǐ)緩衝(chōng)液充(chōng)分浸潤膜。

4.  室(shì)溫，≥10,000 x g 離心 1分鐘。離(lí)心管(guǎn)底部的液(yè)體即(jí)為您純化(huà)後(hòu)的DNA。

5.  （可(kě)選，用於提高得率(shuài)） 將離心(xīn)得到(dào)的(dí)洗(xǐ)脫(tuō)液重新加回柱子(zǐ)吸附(fù)膜(mó)中央，再次離心1分(fēn)鐘。

四， 關(guān)鍵要點(diǎn)與經驗(yàn)總(zǒng)結

1.  比(bǐ)例是關(guān)鍵(jiàn)： “PCR產物：CP Buffer = 1：5" 這個(gè)比例(lì)必(bì)須遵守。這是保(bǎo)證(zhèng)DNA高效結合(hé)到柱上的前提。如(rú)果產物(wù)體(tǐ)積(jī)很小(xiǎo)，可以先(xiān)用(yòng)無(wú)菌水補足到一定體(tǐ)積(jī)（如50μL）再加(jiā)CP Buffer。

2.  乙(yǐ)醇是(shì)必須的(dí)： 使(shǐ)用前務必確(què)認 DNA Wash Buffer 已加(jiā)入(rù)正確(què)量的無(wú)水乙(yǐ)醇。未加乙醇的Wash Buffer無法(fǎ)有(yǒu)效去(qù)除鹽(yán)分。

3.  cedi去除(chú)乙(yǐ)醇： 最(zuì)後(hòu)的 “空離2分(fēn)鐘" 步驟(zhòu)絕(jué)對(duì)不能(néng)省略(lüè)。殘留的(dí)乙(yǐ)醇會(huì)抑(yì)製(zhì)後(hòu)續的酶（如連(lián)接酶，測序(xù)酶等(děng)）活(huó)性(xìng)。離(lí)心後可以(yǐ)打(dǎ)開柱子蓋，在室溫(wēn)下(xià)再放置(zhì)幾(jī)分(fēn)鐘讓(ràng)殘(cán)餘乙(yǐ)醇(chún)wanquan揮發。

4.  提高(gāo)洗脫效率(shuài)：

      預熱Elution Buffer： 將洗脫(tuō)液預熱(rè)至(zhì)65°C或更高(gāo)溫度，可(kě)以顯(xiǎn)著(zhù)提(tí)高(gāo)DNA的洗(xǐ)脫效(xiào)率，從而(ér)提高最(zuì)終(zhōng)得率(shuài)。

      洗(xǐ)脫(tuō)體積(jī)： 洗脫體積越小(xiǎo)，濃度越高，但總得率可能會略有(yǒu)下(xià)降。根據下(xià)遊(yóu)應用(yòng)需(xū)求平衡(héng)。對於(yú)測(cè)序，通(tōng)常(cháng)用15-20μL洗(xǐ)脫；對於需(xū)要高(gāo)濃(nóng)度DNA的(dí)應用，可(kě)以(yǐ)嘗試用10μL洗脫。

5.  關於(yú)DNA片(piàn)段(duàn)大(dà)小(xiǎo)： 該試劑盒適用(yòng)於100bp - 10kb的(dí)片段。對(duì)於(yú)非常(cháng)小的片段(duàn)（如(rú)<100bp的引物(wù)二(èr)聚(jù)體(tǐ)），在高(gāo)鹽(yán)條(tiáo)件下結(jié)合效(xiào)率較(jiào)低，因此可(kě)以被(bèi)有效(xiào)去(qù)除(chú)。對(duì)於非(fēi)常(cháng)大(dà)的(dí)片段(duàn)（>10kb），結合和洗(xǐ)脫效(xiào)率(shuài)會(huì)下降(jiàng)，需酌(zhuó)情增(zēng)加(jiā)結合和(hé)洗(xǐ)脫時間。

五， 下(xià)遊應用

純化(huà)後的(dí)DNA適用(yòng)於：

  Sanger測序(xù)

  限(xiàn)製性內(nèi)切酶消化

  連接與克隆

  體外(wài)轉錄/翻譯(yì)

  下一代(dài)測(cè)序（NGS）文庫構建等(děng)。

六，常(cháng)見問(wèn)題(tí)排查(chá)

——天津(jīn)益(yì)元利康(kāng)生物科技有(yǒu)限公(gōng)司

天(tiān)津益元利康(kāng)生(shēng)物科技(jì)有限公(gōng)司(sī)是(shì)一(yī)家專注於生命(mìng)科(kē)學(xué)的科(kē)技企業(yè)，由在(zài)國內科研試劑領域(yù)有(yǒu)著(zhuó)豐富(fù)從(cóng)業經驗的技(jì)術團隊和(hé)管理(lǐ)團(tuán)隊組建而成，專(zhuān)營(yíng)進口生(shēng)物試(shì)劑，科學儀(yí)器(qì)，實驗(yàn)消耗品(pǐn)，化工原料(liào)及藥物中間(jiān)體等。公司與諸多國外(wài)品(pǐn)牌簽下(xià)代理(lǐ)，RD，Abcam，CST，Genetex，Biolegend，ebioscience，polypure，polyplus，Bethyl，Novus等，能為廣大科研(yán)用戶提(tí)供數萬種(zhǒng)試劑(jì)，儀(yí)器和(hé)實驗消(xiāo)耗品。
公司將(jiāng)不斷(duàn)把國(guó)際(jì)上(shàng)優質的(dí)產品引(yǐn)入國(guó)內市(shì)場(cháng)，滿足(zú)客戶的需(xū)求，公司也(yě)將(jiāng)緊跟(gēn)生(shēng)命(mìng)科(kē)學的發展，為(wéi)廣(guǎng)大科(kē)研(yán)工(gōng)作(zuò)者探索生命科學(xué)的奧秘(mì)奉(fèng)獻(xiàn)綿(mián)薄之力(lì)
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