材(cái)料與儀器(qì)

磷酸鹽(yán)緩衝(chōng)溶(róng)液 硫(liú)氰(qíng)酸胍(guā)溶液(yè) CsCl TES 緩衝液(yè) 乙(yǐ)酸(suān)鈉緩衝(chōng)液 無(wú)水乙醇(chún) 經 DEFC 處理(lǐ)的水(shuǐ)
。
離心機 注射器(qì)及(jí)20W針頭

步驟

一 材(cái)料(liào)與(yǔ)設(shè)備(bèi)
1) 磷酸(suān)鹽(yán)緩(huǎn)衝溶液 (PBS)
2) 硫氰酸(suān)胍溶液：4mol/L 硫(liú)氰(qíng)酸胍(guā)，0.lmmol/LTris-HClpH7.5，1%β-巰(qiú)基乙醇(chún)
3)CsCl5.7mol/：L(DEPC 處(chǔ)理(lǐ)）
4)TES 緩衝液:0.1%SDS，10 mmol/LTris-ClpH7.4，lmmol/LEDTA
5)3 mmol/L 乙酸(suān)鈉(nà)緩衝液(yè) (PH5.2，DEPC 處(chǔ)理(lǐ)）
6) 無(wú)水(shuǐ)乙醇
7) 經 DEFC 處理(lǐ)的水(shuǐ)
8) 離(lí)心機(jī)
9)6 ml 注(zhù)射器及(jí) 20W 針頭(tóu)
二(èr) 操(cāo)作方法
1. 單層培養細胞(bāo)
1) 室溫下(xià)用 PBS 洗(xǐ)滌(dí)細(xì)胞(bāo)，每(měi)平皿 5 ml 洗滌(dí) 2 次(cì)
。
2) 在不超過 105 個細(xì)胞(bāo)中加人(rén) 3.5 ml 硫氰酸(suān)胍溶液(yè)，使之遍布整(zhěng)個平皿(mǐn)
。用(yòng)橡膠(jiāo)細胞(bāo)刮於擦(cā)刮(guā)平(píng)皿(mǐn)，回(huí)收黏(nián)稠(chóu)的(dí)細胞(bāo)裂解液，用裝有 20-G 針(zhēn)頭的注(zhù)射(shè)器往返抽吸裂(liè)解物，舍(shě)並在(zài)一起
2. 懸(xuán)浮(fú)培養細(xì)胞(bāo)
1) 離心(xīn)回(huí)收≤l08 個(gè)細(xì)胞，用相當於 1/2 原有(yǒu)體積的(dí) PBS 重懸(xuán)之，並再(zài)次離心(xīn)回(huí)收細(xì)胞(bāo)
。
2) 往離心管中加(jiā)人 3.5 ml 硫(liú)氰酸胍溶(róng)液
。
3) 用裝(zhuāng)有(yǒu) 20-G 針(zhēn)頭的(dí) 6 ml 注(zhù)射(shè)器(qì)將黏(nián)稠的(dí)細胞裂解液(yè)往返(fǎn)抽吸(xī) 4 次，並將其移至(zhì)一個幹(gān)淨的試(shì)管中(zhōng)
。本(běn)步驟(zhòu)的(dí)重(zhòng)要性(xìng)在於(yú)可(kě)對(duì)染色(sè)體 DNA 進行剪切(qiē)，以(yǐ)降低(dī)溶(róng)液的(dí)黏(nián)度(dù)，
4) 在經矽化(huà)井(jǐng)高壓(yā)過的 13 mmX51 mm 的超速離心(xīn)管中(zhōng)，加人 1.5 ml 5.7mol/LCsCl 並在 CsCl 層(céng)加人(rén) 3.5 ml 細胞裂解液(yè)，界(jiè)麵(miàn)應(yīng)保持(chí)清(qīng)晰(xī)
。1)〜4) 步的操(cāo)作(zuò)均在(zài)室(shì)溫(wēn)進(jìn)行
。
5) 於(yú) 18℃，150000g 離(lí)心 12〜20 h(緩慢加速和(hé)減速）
6) 用巴(bā)斯德吸(xī)管的(dí)管(guǎn)尖在(zài)液(yè)麵(miàn)上(shàng)吸取上(shàng)清，管(guǎn)子隨液麵(miàn)的下(xià)降而下降(jiàng)
。當(dāng)吸至(zhì)僅剩(shèng)約 100 ul 時，小心(xīn)倒置管子(zǐ), 倒出(chū)剩餘液體(tǐ)在界麵處(chǔ)應有一(yī)白色的 DNA 帶，必須仔(zī)細地wan全移(yí)去(qù)此帶(dài)，因(yīn)為它(tā)含(hán)有染色(sè)體 DNA
。
7) 晾於沉澱(diàn)約 5〜lOmin，然後(hòu)以(yǐ) 360ul TES 溶液(yè)重(zhòng)溶(róng)沉(chén)澱(diàn)，反復(fù)用吸管上下抽吸(xī)，如此在(zài)室(shì)溫逬(bèng)行(háng) 5〜l0 min，轉移(yí)溶液於另一幹淨的微量離心管
。
8) 加(jiā)人(rén) 40u 13 mol/L pH5.2 的乙酸(suān)鈉(nà)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)和(hé) 1 ml 無(wú)水乙醇，在幹冰/乙(yǐ)醇(chún)中(zhōng)沉澱(diàn) 30mim，離心(xīn) 10〜15 min, 用(yòng) 360 ul 水重(zhòng)溶沉澱(diàn)並(bìng)重復(fù)沉(chén)澱過(guò)程
。
9) 沉澱(diàn)晾幹 l0 min, 溶解(jiě)於 20ul 水中(zhōng)，取 10ul 稀釋至 lml，測 A260 和 A280. 最後，以水(shuǐ)溶液或(huò)乙(yǐ)醇沉(chén)澱(diàn)的形式(shì)在一 70℃ 儲存(cún) RNA
。

注意事(shì)項

1) 要(yào)用足(zú)夠(gòu)的(dí)時間(jiān)去重溶沉澱，否則 RNA 的(dí)產量會有(yǒu)顯(xiǎn)著(zhù)下(xià)降
。
2) 小 RNA 在 CsCl 中離心時不(bù)能有效地沉(chén)澱，因此不能(néng)用(yòng)此方法製(zhì)備(bèi) 5SRNA 和 tRNA 等分子
。
3) 乙醇(chún)可以(yǐ)洗去沉(chén)澱(diàn)中(zhōng)的(dí)氯(lǜ)化銫. 使沉澱(diàn)易於溶解(jiě)

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