原(yuán)理

紅細(xì)胞裂解液(yè)選(xuǎn)擇(zé)性裂解(jiě)紅(hóng)細(xì)胞,然(rán)後du特的裂解液/β-巰基乙醇迅速(sù)裂解白細(xì)胞(bāo)和(hé)滅(miè)活(huó)細胞RNA酶(méi)，然後用(yòng)乙醇調節(jié)結合(hé)條(tiáo)件後，RNA在高(gāo)離序(xù)鹽狀態下選擇性吸(xī)附(fù)於離心(xīn)柱內矽基(jī)質(zhì)膜， 再通(tōng)過一(yī)係(xì)列(liè)快(kuài)速(sù)的漂(piāo)洗-離心(xīn)的(dí)步(bù)驟, 去蛋(dàn)白(bái)液(yè)和(hé)漂(piāo)洗液將細(xì)胞代謝(xiè)物，蛋(dàn)白(bái)等雜質(zhì)去除，最後低鹽(yán)的(dí)RNase free H20將純淨RNA從矽基質(zhì)膜(mó)上(shàng)洗(xǐ)脫(tuō)。

材料與(yǔ)儀器

鮮(xiān)血(xiě)液
抗凝(níng)劑 紅細(xì)胞裂解液RLB 去蛋白液RW1 乙醇 漂洗液(yè)RW
製(zhì)冰機(jī) 離心(xīn)機 離(lí)心管(guǎn) 移(yí)液(yè)槍(qiāng) 移(yí)液管(guǎn) 針頭 注射器 水(shuǐ)浴(yù)鍋(guō)

步驟(zhòu)

一，在適合(hé)大小的(dí)RNase free離心管中(zhōng)加入1體積（<1.5 ml）加入各(gè)種抗凝(níng)劑新鮮血(xiě)液 (顛倒混(hùn)匀後(hòu))和3體積(jī)的(dí)紅細胞裂解(jiě)液RLB，顛(diān)倒混匀，可輕彈管(guǎn)壁，確保混匀(yún)。

二，室溫放置(zhì)10分鐘（期(qī)間應(yīng)該顛倒輕彈混匀(yún)數次(cì)幫助裂(liè)解紅細胞）。

如(rú)果(guǒ)RNA降(jiàng)解嚴(yán)重，可在冰上裂解，但是(shì)時間可長一些以充分裂(liè)解。

三，12 000 rpm離(lí)心20秒(miǎo)，倒(dǎo)棄紅色上清，並(bìng)小心的盡可能(néng)多(duō)的(dí)吸棄(qì)上清(qīng)（注(zhù)意不要吸到管(guǎn)底的(dí)細(xì)胞(bāo)團(tuán)），留(liú)下完(wán)整的管底白細(xì)胞團(tuán)。

離(lí)心(xīn)後在管底應(yīng)該見到白(bái)色(sè)的(dí)白(bái)細(xì)胞(bāo)團，也可能有一些紅細(xì)胞殘片(piàn)和白細(xì)胞團在一起，但(dàn)是如(rú)果看到的是大部分的紅(hóng)色細(xì)胞團(tuán)，說明紅細胞裂(liè)解很不(bù)充分(fēn)，應(yīng)該再(zài)加(jiā)入(rù)紅(hóng)細胞裂解(jiě)液重(zhòng)懸細胞團(tuán)後重復步(bù)驟二，三(sān)。

上清盡(jìn)可能的吸棄(qì)，殘留過(guò)多(duō)會(huì)稀釋(shì)裂(liè)解液(yè)，造(zào)成(chéng)裂(liè)解結合(hé)異(yì)常，產量純度(dù)降低。

四，渦(wō)旋或者輕彈(dàn)管(guǎn)壁(bì)將(jiāng)白(bái)細(xì)胞沉澱wan全鬆(sōng)散(sàn)重(zhòng)懸，加(jiā)入350 ul（<0.5 ml全血）或者600 ul（0.5-1.5ml全血）裂(liè)解(jiě)液RLT，吹打(dǎ)混(hùn)匀後用手(shǒu)劇(jù)烈振蕩20秒，充分(fēn)裂解(jiě)。病人(rén)血樣中白(bái)細(xì)胞(bāo)數量(liáng)可(kě)能(néng)大(dà)幅(fú)增加，應(yīng)該適當減少處(chǔ)理量。或者按(àn)照(zhào)350 ul（<2x106白(bái)細胞）或者600 ul（2x106-1x107白(bái)細(xì)胞）比(bǐ)例加RTL。

五，用帶(dài)鈍(dùn)針(zhēn)頭的一次(cì)性 1 ml(配0.9 mm針(zhēn)頭(tóu)) 注射(shè)器抽打裂解(jiě)物 5-10 次或直(zhí)到得(dé)到(dào)滿意匀漿結果(或者電動(dòng)匀漿(jiāng)30秒(miǎo))，可以剪切DNA，降低(dī)粘稠度(dù)和(hé)提(tí)高產(chǎn)量。

六，較(jiào)精確估計裂解物體(tǐ)積，加入等體積的70%乙醇(chún)（請(qǐng)先(xiān)檢查是否已加入(rù)無(wú)水乙醇!），此(cǐ)時可能(néng)出(chū)現沉澱(diàn)，但(dàn)是不(bù)影(yǐng)響提(tí)取過程，立(lì)即吹打混(hùn)匀，不要(yào)離(lí)心(xīn)。

七，立刻將混(hùn)合(hé)物(每次小於(yú)700 ul，多可以(yǐ)分兩(liǎng)次(cì)加(jiā)入)加(jiā)入一個(gè)吸附柱RA中，（吸附(fù)柱(zhù)放(fàng)入收集管中）13 000 rpm離(lí)心60秒(miǎo)，棄(qì)掉廢液(yè)。

八，加(jiā)700 ul 去(qù)蛋(dàn)白(bái)液(yè)RW1，室(shì)溫(wēn)放置(zhì)30秒(miǎo)，12 000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

如果DNA殘留(liú)明顯，可在加入RW1後室溫放(fàng)置5分鐘再(zài)離(lí)心。

九，加(jiā)入500 ul漂(piāo)洗(xǐ)液RW（請先檢(jiǎn)查(chá)是否已加(jiā)入無水(shuǐ)乙(yǐ)醇），12 000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄(qì)掉廢(fèi)液。加入500 ul漂(piāo)洗液(yè)RW，重復一遍。

十，將(jiāng)吸(xī)附柱RA放回空收(shōu)集(jí)管中，13 000 rpm離(lí)心(xīn)2分鐘，盡量(liáng)除(chú)去漂洗(xǐ)液， 以(yǐ)免漂(piāo)洗(xǐ)液(yè)中(zhōng)殘留(liú)乙醇抑(yì)製(zhì)下遊(yóu)反(fǎn)應。

十一(yī)，取出(chū)吸(xī)附(fù)柱(zhù)RA，放(fàng)入一個(gè)RNase free離心(xīn)管(guǎn)中(zhōng)，根(gēn)據預期(qī)RNA產量在吸附(fù)膜(mó)的中(zhōng)間(jiān)部位加(jiā)30-50 ul RNase freewater（事先在(zài) 70-80℃水(shuǐ)浴(yù)中加熱效果(guǒ)更(gēng)好）， 室溫放(fàng)置(zhì)1分(fēn)鐘(zhōng)，12 000 rpm 離心(xīn)1分鐘。

十(shí)二，如(rú)果提(tí)取全血(xiě)>0.5 ml或者>2x106白細(xì)胞，加30-50 ul RNase free water重(zhòng)復(fù)步(bù)驟(zhòu)十(shí)一(yī)，合(hé)並兩次(cì)洗(xǐ)脫液，或者使用(yòng)第一次(cì)的(dí)洗(xǐ)脫(tuō)液(yè)加(jiā)回到(dào)吸(xī)附柱重復步驟(zhòu)一遍(如(rú)果(guǒ)需要RNA濃(nóng)度高)。

洗脫(tuō)兩遍的RNA洗(xǐ)脫(tuō)液濃(nóng)度高，分(fēn)兩次(cì)洗脫合並洗脫液的RNA產量比前(qián)者高15-30%，但(dàn)是濃度要低(dī)，用戶(hù)根(gēn)據需(xū)要(yào)選(xuǎn)擇。

注意(yì)事項(xiàng)

1. 第一次(cì)使用前(qián)請(qǐng)先在漂(piāo)洗液(yè)RW瓶(píng)和70%乙醇瓶(píng)中(zhōng)加入zhi定量(liáng)無(wú)水乙(yǐ)醇(chún)。

2. 使用(yòng)前將(jiāng)10X紅細(xì)胞(bāo)裂解液RLB用DEPC處理水稀(xī)釋到1X。

3. 操(cāo)作前在裂(liè)解(jiě)液RLT中(zhōng)加(jiā)入β-巰(qiú)基乙醇至終(zhōng)濃(nóng)度1%，如(rú)1 ml RLT 中(zhōng)加(jiā)入(rù)10 ul β-巰基(jī)乙醇。此(cǐ)裂(liè)解(jiě)液最好現用現配(pèi)。配(pèi)好(hǎo)的(dí)RLT 4℃可放置一個月。

常見問題

1. 第一次(cì)使用前請(qǐng)先在(zài)漂洗(xǐ)液RW瓶和70%乙醇瓶中(zhōng)加(jiā)入(rù)zhi定(dìng)量(liáng)無水(shuǐ)乙醇(chún)。

2. 使(shǐ)用(yòng)前將10X紅細胞裂解(jiě)液RLB用DEPC處(chǔ)理水(shuǐ)稀(xī)釋(shì)到(dào)1X。

3. 操(cāo)作前在(zài)裂解(jiě)液RLT中加入(rù)β-巰基乙(yǐ)醇(chún)至終濃度1%，如(rú)1 ml RLT 中(zhōng)加入10 ul β-巰(qiú)基乙(yǐ)醇。此裂(liè)解液(yè)最好現用(yòng)現配(pèi)。配(pèi)好的(dí)RLT 4℃可放置一(yī)個(gè)月。

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