醛(quán)基(jī)活化瓊脂糖(táng)基(jī)質(zhì)在製(zhì)備和(hé)使用定製(zhì)親和(hé)層析介質方麵具有(yǒu)良好的記(jì)錄。將生(shēng)物(wù)特異(yì)性配體(tǐ)與(yǔ)醛基活化(huà)瓊(qióng)脂糖(táng)偶聯是(shì)一(yī)項成(chéng)功且(qiě)有據(jù)可查的技(jì)術。

通過(guò)還原(yuán)胺化反(fǎn)應與(yǔ)含有伯胺(àn)基(jī)團的(dí)配(pèi)體(tǐ)形成(chéng)化(huà)學穩定(dìng)的仲(zhòng)胺(àn)鍵(jiàn)。這種(zhǒng)預活化的瓊脂糖(táng)基(jī)質(zhì)可用於(yú)親(qīn)和層(céng)析介(jiè)質的定製(zhì)，適用於小規模和大(dà)規模(mó)純(chún)化(huà)應用。

1. 屬性

有(yǒu)2種基質(zhì)可供(gōng)選擇(zé)，適合(hé)各種待偶聯或(huò)純化的分(fēn)子。

• Aldehyde-activated SepFast 4 High Flow (4HF) 由高(gāo)度交聯的(dí)4%珠狀瓊脂糖(táng)組成(chéng)。其大孔(kǒng)徑適用(yòng)於(yú)偶聯或純化大(dà)分子(zǐ)。它具(jù)有高機械剛度，可在降低背壓(yā)的情況(kuàng)下(xià)實現(xiàn)高流(liú)量(liáng)。

• Aldehyde-activated SepFast 6 High Flow (6HF) 由高度(dù)交聯(lián)的6%珠狀瓊(qióng)脂(zhī)糖(táng)組(zǔ)成(chéng)。其適(shì)中的(dí)孔徑適用於偶(ǒu)聯(lián)較(jiào)小(xiǎo)的(dí)分子。它也(yě)具有高(gāo)機(jī)械剛度，可在降低(dī)背壓的情(qíng)況(kuàng)下(xià)實(shí)現高流(liú)量。

由於瓊脂(zhī)糖具有(yǒu)出色的親(qīn)水(shuǐ)性(xìng)和低非(fēi)特異(yì)性結合(hé)特(tè)性(xìng)，長(cháng)期以來(lái)一直用於(yú)色(sè)譜分離。這些顆粒(lì)具(jù)有開孔(kǒng)結構(gòu)，對各種(zhǒng)分子具(jù)有(yǒu)出色的(dí)傳質性能。基質通(tōng)過氧(yǎng)化被激活(huó)以產生醛(quán)基，它直接(jiē)與(yǔ)分(fēn)子(zǐ)中的伯胺基反應，在(zài)還(huán)原(yuán)劑存(cún)在(zài)的情況下被固定化(huà)。

Aldehyde-activated SepFast以(yǐ)20%乙醇(chún)中(zhōng)的(dí)水懸浮液形式提(tí)供(gōng)。

表1  Aldehyde-activated SepFast 4HF/6HF的(dí)特(tè)性

2. 配體固定(dìng)化

以(yǐ)下是一般的(dí)配(pèi)體偶聯(lián)程序。

2.1  將(jiāng)目(mù)標配(pèi)體(tǐ)溶(róng)解在(zài)偶聯(lián)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)中(zhōng)，0.1 M磷酸鈉，pH 7.0。一般對於蛋白(bái)質配體(tǐ)，凝膠的製(zhì)備(bèi)濃(nóng)度(dù)為(wéi)5 - 20 mg/ml。對(duì)於小配(pèi)體，凝膠的製備(bèi)濃度為10 - 100  µmol/ml。偶聯(lián)緩衝液(yè)的(dí)體(tǐ)積可以是(shì)固定凝膠(jiāo)體積的一(yī)半或相同。

2.2  在(zài)過濾裝(zhuāng)置中用至(zhì)少5 倍體(tǐ)積(jī)的偶(ǒu)聯(lián)緩衝(chōng)液清洗(xǐ)醛(quán)活化凝(níng)膠。

2.3  將洗(xǐ)淨並(bìng)吸幹的凝膠(jiāo)（來自步(bù)驟  2.2）轉移(yí)到步驟(zhòu)  2.1 製(zhì)備的溶液(yè)中。

如(rú)果(guǒ)發(fā)生變化(huà)，請調(tiáo)整(zhěng) pH 值(zhí)。

2.4  將(jiāng)漿(jiāng)液(yè)在通(tōng)風良(liáng)好的通(tōng)風(fēng)櫥(chú)中(zhōng)在(zài)室溫下(xià)混合 2‑4 小時(shí)。

2.5  將氰基(jī)硼QING化(huà)鈉（0.5 g/100 ml  活(huó)性(xìng)凝(níng)膠(jiāo)）加入(rù)漿液中(zhōng)，過夜(yè)。注意：氰(qíng)基硼QING化鈉有毒，應(yīng)格(gé)外(wài)小心處理。

2.6  用(yòng)至(zhì)少 5 倍凝膠(jiāo)體積的偶(ǒu)聯緩衝(chōng)液(yè)清洗凝膠。

2.7 在(zài)氰基硼QING化鈉(nà)存(cún)在下(xià)，將凝膠(jiāo)重(zhòng)新懸浮(fú)到(dào)相同體積的(dí)封閉溶液，0.1 M Tris/HCl，pH 8.0或(huò)1 M乙(yǐ)醇胺，pH 8.0中(zhōng)2-3小時。

2.8 用5倍(bèi)體積的(dí)0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0 洗(xǐ)滌凝膠(jiāo)，然(rán)後(hòu)用(yòng)5倍(bèi)體積(jī)的0.1 M醋酸鹽緩衝(chōng)液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗滌(dí)凝(níng)膠。

2.9 使(shǐ)用前用工作(zuò)/平衡緩(huǎn)衝液清洗凝膠。

3. 固(gù)定(dìng)化效(xiào)率(shuài)的一般考(kǎo)慮(lǜ)

3.1 pH

還(huán)原(yuán)胺(àn)化(huà)可(kě)以(yǐ)在pH 4 - 10之間非(fēi)常有(yǒu)效地進行。但(dàn)是可(kě)以(yǐ)優(yōu)化偶(ǒu)聯pH以(yǐ)獲得最(zuì)佳(jiā)結(jié)果(guǒ)（例如，高(gāo)偶聯產(chǎn)率和(hé)高配(pèi)體活(huó)性）。

在配(pèi)體溶解(jiě)後要注意調(tiáo)整偶(ǒu)聯(lián) pH 值。

3.2 偶聯(lián)方(fāng)案(àn)

應避免使用(yòng)含(hán)有氨(ān)基的(dí)溶液(yè)。

可(kě)以(yǐ)引(yǐn)入(rù)稀釋(shì)的某(mǒu)些有機(jī)溶劑以(yǐ)提高配體的(dí)溶解度(dù)。應事先測試此(cǐ)類(lèi)溶劑的(dí)適用(yòng)性。

耦合溶液(yè)的(dí)體(tǐ)積(jī)與(yǔ)活(huó)化凝(níng)膠(jiāo)的(dí)體積(jī)保(bǎo)持一致。建(jiàn)議使用(yòng)0.5-1 : 1 v/v的(dí)理(lǐ)想比(bǐ)例。

3.3 鹽

偶聯(lián)緩衝液中(zhōng)鹽的存(cún)在(zài)（例如(rú)0.5  M 或飽(bǎo)和(hé)）可以提(tí)高固定效(xiào)率(shuài)。

3.4 基礎(chǔ)基(jī)質(zhì)中的活化基(jī)團(tuán)

對於某些配(pèi)體或(huò)應用(yòng)，基礎(chǔ)基(jī)質(zhì)中的活(huó)化(huà)水(shuǐ)平可能(néng)過高(gāo)，偶聯配(pèi)體(tǐ)的(dí)活(huó)性(xìng)可(kě)能(néng)會(huì)降低(dī)。

在(zài)降低的(dí) pH 值下(xià)偶(ǒu)聯可(kě)能會(huì)減少配體(tǐ)分(fēn)子(zǐ)的(dí)連(lián)接(jiē)點(diǎn)。它可以提(tí)高偶聯(lián)配體的活性。活化(huà)基團的受控封(fēng)閉(bì)，例如在添(tiān)加配體前幾個小時用  5‑10  mM  封(fēng)閉(bì)緩(huǎn)衝液(yè)孵育凝膠(jiāo)，也(yě)可以減(jiǎn)少過(guò)度偶聯(lián)問題。

3.5 反應(yīng)時(shí)間

可以優化偶(ǒu)聯過(guò)程中配體和(hé)活(huó)化(huà)介(jiè)質之間的(dí)接觸(chù)時間以(yǐ)保持配體(tǐ)的生物活性。

3.6 還原劑的(dí)選擇

其他還原(yuán)劑(jì)如(rú)硼(péng)QING化鈉可(kě)用於偶聯(lián)反(fǎn)應。氰(qíng)基(jī)硼(péng)氫(qīng)化物是(shì)一(yī)種較溫(wēn)和的還原(yuán)劑(jì)，它(tā)隻還原醛基和(hé)伯胺基(jī)之間形(xíng)成的(dí)中間席(xí)夫鹼(jiǎn)，得(dé)到(dào)穩定(dìng)的仲胺鍵。硼氫化(huà)物(wù)是一(yī)種更強(qiáng)的還(huán)原劑(jì)，可還(huán)原(yuán)席(xí)夫(fū)鹼和未(wèi)偶聯(lián)的醛基(jī)。

3.7 屏(píng)蔽(bì)剩餘(yú)的活化配體

未(wèi)與配(pèi)體(tǐ)反應的活化基團應通過添加(jiā)含有(yǒu)pH 8 - 9伯胺的額(é)外(wài)小分(fēn)子（例如 Tris 或乙醇(chún)胺）來封(fēng)端。

3.8 最終(zhōng)介(jiè)質的洗滌(dí)

偶聯反應(yīng)後需要(yào)將(jiāng)未(wèi)連(lián)接(jiē)或弱連(lián)接(jiē)的配(pèi)體WAN全洗掉。采用(yòng)高(gāo)pH值和(hé)低pH值(zhí)交替的洗滌(dí)方法可以(yǐ)確(què)保有效去(qù)除不需要的物質(zhì)。

4. 固(gù)定化(huà)親和(hé)介(jiè)質(zhì)的使用

配體偶(ǒu)聯(lián)介(jiè)質可用於(yú)使(shǐ)用(yòng)間歇攪(jiǎo)拌罐模式(shì)或(huò)填(tián)充柱模式的純(chún)化。處理這種材(cái)料遵(zūn)循(xún)與處理其(qí)他基於(yú)瓊脂糖基質(zhì)相(xiāng)同的(dí)原(yuán)則。

5. 儲(chǔ)存(cún)

應(yīng)在8℃下(xià)儲存(cún)。偶聯的濕介質(zhì)應在防(fáng)菌(jūn)劑（例如20%乙醇(chún)）存在的情況下於4-8℃儲(chǔ)存。切勿(wù)凍(dòng)存(cún)耦(ǒu)合介(jiè)質。

6. 更多信息(xī)

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