雙螢(yíng)光素(sù)酶報告(gào)基因通常(cháng)以(yǐ)螢火(huǒ)蟲(chóng)螢光素(sù)酶(méi)為(wéi)報告(gào)基因，以(yǐ)海(hǎi)腎螢光素酶為(wéi)內參(cān)基(jī)因(yīn)，如此所(suǒ)構成的(dí)報告係統(tǒng)有檢測(cè)靈敏(mǐn)度高，動態範圍廣，內參平衡等(děng)優勢，因(yīn)此(cǐ)在(zài)實(shí)驗中(zhōng)得到廣(guǎng)泛(fàn)應用。那麼(mó)你知道雙(shuāng)熒(yíng)光素(sù)酶實(shí)驗(yàn)的(dí)注意(yì)事項(xiàng)有哪些嗎？讓(ràng)我們(mén)一起(qǐ)來(lái)看看吧！

一(yī)，熒光(guāng)值(zhí)過高(gāo)

熒(yíng)光值(zhí)過高(gāo)可能(néng)會超出(chū)儀器檢測(cè)範(fàn)圍，從(cóng)而檢測不(bù)到值，一(yī)般讀數(shù)在(zài)5-6位(wèi)之間(jiān)較好。熒(yíng)光值(zhí)過高可通(tōng)過以下方式嘗(cháng)試解(jiě)決：

1.減(jiǎn)少質(zhì)粒(lì)轉染(rǎn)量(liáng)；

2.細(xì)胞樣品(pǐn)裂解後，離心取上清(qīng)後(hòu)檢(jiǎn)測或(huò)對裂解產物進(jìn)行稀釋後(hòu)檢測。

（注(zhù)：不(bù)建(jiàn)議(yì)通過減少(shǎo)底物(wù)量來降低熒(yíng)光(guāng)值，需(xū)要保證(zhèng)底(dǐ)物的(dí)飽和(hé)來(lái)反(fǎn)映(yìng)熒(yíng)光素酶真實(shí)的表達(dá)水(shuǐ)平(píng)，否則會(huì)造(zào)成(chéng)檢測(cè)結果出(chū)現大的偏差。）

二，熒光值(zhí)過低或(huò)無熒(yíng)光值

1. 啟動(dòng)子(zǐ)活性低

a.優(yōu)化細胞的培養條(tiáo)件，提(tí)高(gāo)熒(yíng)光素酶的表達量；

b.更(gēng)換強(qiáng)啟(qǐ)動(dòng)子（如SV40，CMV）。

2. 轉染(rǎn)效率低(dī)

a.優(yōu)化(huà)轉染實驗條件，用(yòng)較易(yì)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽性(xìng)對(duì)照（如轉染過表達(dá)熒光蛋(dàn)白(bái)質(zhì)粒(lì)）；

b.確(què)保(bǎo)轉染DNA的質(zhì)量，可(kě)通(tōng)過(guò)酶(méi)切或瓊脂糖凝膠電(diàn)泳的(dí)方法(fǎ)對DNA質(zhì)量(liáng)進(jìn)行鑒定；

c.選擇(zé)活性(xìng)較(jiào)高，處於(yú)指數分裂(liè)期(qī)的細(xì)胞進行(háng)轉染(rǎn)。

3. 樣(yàng)品裂(liè)解(jiě)效(xiào)率(shuài)低

a.細胞培(péi)養(yǎng)時(shí)間(jiān)不宜(yí)過長(cháng)，12-36h內最(zuì)好(hǎo)，長時間培養後，細(xì)胞可能會難裂解；

b.加入的(dí)裂解(jiě)液(yè)需(xū)足量，保證細胞能夠充分(fēn)裂(liè)解(jiě)。

4. 熒(yíng)光信號(hào)衰減(jiǎn)

熒光素酶(méi)的(dí)半衰期(qī)一般(bān)約(yuē)30min，加完底物後(hòu)可立(lì)即檢(jiǎn)測(cè)，盡量在(zài)30min內(nèi)完成。

5. 底物氧(yǎng)化失效(xiào)

a.底(dǐ)物(wù)避光密封保存，螢火(huǒ)蟲熒光素酶底物-20℃保存(cún)；海腎(shèn)熒光(guāng)素(sù)酶(méi)底物推(tuī)薦-80℃保存；

b. 反應(yīng)工作(zuò)液建議現用(yòng)現配(pèi)。

三，如何(hé)判斷(duàn)轉染(rǎn)成功

1. 如(rú)轉(zhuǎn)入(rù)的(dí)miRNA帶熒光標記如(rú)GFP，則可直接(jiē)在(zài)轉(zhuǎn)染後，細胞(bāo)裂(liè)解(jiě)前，顯微鏡下觀察細胞熒光(guāng)；

2. 如轉(zhuǎn)入的miRNA不(bù)帶任何熒光標記，可考慮(lǜ)進(jìn)行(háng)miRNA的(dí)qRT-PCR檢測，通過檢測結果判斷實驗組(zǔ)2，4，6是否相(xiāng)對其(qí)對照組(zǔ)miRNA有顯著過表(biǎo)達；

3.設置一(yī)個熒(yíng)光(guāng)質(zhì)粒(lì)轉染(rǎn)參照組(zǔ)，同批轉染一(yī)個組的細(xì)胞(bāo)，間(jiān)接反(fǎn)映(yìng)出(chū)同(tóng)批(pī)次(cì)實驗的轉染情(qíng)況。

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